مراحل مهندسی ژنتیک (صفحه 93 تا 96)

مراحل مهندسی ژنتیک: 1 – جداسازی قطعه ای از دِنا 2 – اتصال قطعه دِنا به ناقل و تشکیل دِنای نوترکیب 3 – وارد کردن دِنای نوترکیب به یاخته میزبان 4 – جداسازی یاخته های تراژنی

مراحل مهندسی ژنتیک ← جداسازی قطعه ای از دِنا: این کار به وسیلۀ آنزیم های برش دهنده انجام می شود.

آنزیم های برش دهنده در باکتری ها وجود دارند و قسمتی از سامانۀ دفاعی آنها محسوب می شوند.

اولین مرحله از همسانه سازی که جداسازی ژن ها است، به وسیلۀ آنزیم های برش دهنده، انجام می شود.

آنزیم های برش دهنده توالی های نوکلئوتیدی خاصی را در دنا تشخیص و برش می دهند. به این توالی جایگاه تشخیص آنزیم گفته

می شود.

شکل ٢ – برش مولکول دنا توسط آنزیم EcoR1

مثال برای آنزیم برش دهنده و جایگاه تشخیص آن: آنزیم EcoR1 توالی شش جفت نوکلئوتیدی را شناسایی و برش می دهد (شکل توالی).

در جایگاه تشخیص آنزیم EcoR1، توالی نوکلئوتیدهای هر دو رشته دنا از دو سمت مخالف یکسان خوانده می شود.

آنزیم برش دهنده EcoR1، پیوند فسفودی استر بین نوکلئوتید گوانین دار و آدنین دار هر دو رشته را برش می زند.

در نتیجه برش دنا توسط آنزیم EcoR1، انتهایی از مولکول دنا ایجاد می شود که یک رشته آن بلندتر از رشته مقابل است و به آن انتهای چسبنده می گویند.

برای تشکیل انتهای چسبنده از مولکول دنا، علاوه بر پیوندهای فسفودی استر، پیوندهای هیدروژنی بین دو رشته دنا در منطقه تشخیص نیز شکسته می شوند.

استفاده از آنزیم های برش دهنده، دنا را به قطعات کوتاه تری تبدیل می کند. این قطعات را با روش های خاصی جدا می کنند و تشخیص می دهند.

– مرحله دوم مهندسی ژنتیک – ، اتصال قطعه دنای جداسازی شده به ناقل همسانه سازی است.

ناقلین همسانه سازی، توالی های دنایی هستند که در خارج از فام تن اصلی قرار دارند و می توانند مستقل از آن تکثیر شوند.

یکی از ناقلین همسانه سازی، دیسَک حلقوی باکتری است. این نوع دیسَک یک مولکول دنای دورشته ای و خارج فام تنی است که معمولاً درون باکتری ها و بعضی قارچ ها مثل مخمرها وجود دارد و می تواند مستقل از ژنوم میزبان همانندسازی کند.

دیسَک ها را فام تَن های کمکی نیز می نامند چون حاوی ژن هایی هستند که در فام تن اصلی باکتری وجود ندارند. مثلاً ژن مقاومت به پادزیست در دیسَک قرار دارد.

در صورت انتقال قطعه دنای مورد نظر به دیسَک و ورود آن به یاخته میزبان، با هر بار همانندسازی دیسَک، دنای مورد نظر نیز همانندسازی می شود.

در مهندسی ژنتیک، بهتر است از دیسَکی استفاده شود که فقط یک جایگاه تشخیص برای آنزیم برش دهنده داشته باشد. به نظر شما چرا؟

شکل 3 طرح ساده ای از دیسَک دارای یک جایگاه تشخیص آنزیم EcoR1 را نشان می دهد،

شکل ٣ طرح ساده ای از دیسَک و یک ژن خارجی

بسیاری از دیسَک ها دارای ژن های مقاومت به پادزیست ها هستند.

ژن های مقاومت به پادزیست ها به باکتری این توانایی را می دهند که پادزیست ها را به موادی غیرکشنده و قابل استفاده برای خود تبدیل کنند. این ویژگی در مهندسی ژنتیک اهمیت زیادی دارد.

در ساخت یک دنای نوترکیب، قطعه دنای حاوی توالی مورد نظر در دنای ناقل جاسازی می شود.

در مهندسی ژنتیک: برای جداسازی قطعه دنای مورد نظر از نوعی آنزیم برش دهنده استفاده می شود. توجه داشته باشید آنزیم مورد استفاده برای برش دادن دیسَک، باید همان آنزیمی باشد که در جداسازی دنای مورد نظر استفاده شده است. چرا؟

برش دیسَک با آنزیم – برش دهنده – ، آن را به یک قطعه دنای خطی تبدیل می کند که دارای دو انتهای چسبنده است. همچنین قطعه دنای خارجی نیز دو انتهای چسبنده دارد.

برای اتصال دنای مورد نظر به دیسَک از آنزیم لیگاز (اتصال دهنده( استفاده می شود.

آنزیم لیگاز پیوند فسفودی استر بین دو انتهای مکمل را ایجاد می کند.

به مجموعه دنای ناقل و ژن جاگذاری شده در آن، دنای نوترکیب گفته می شود (شکل 4(.

وارد کردن دِنای نوترکیب به یاخته میزبان: در این مرحله، دنای نوترکیب را به درون یاخته میزبان مثلاً باکتری منتقل می کنند (شکل ۵(. به این منظور باید در دیواره باکتری منافذی ایجاد شود.

به منظور وارد کردن دنای نوترکیب به باکتری، باید در دیواره باکتری منافذی ایجاد شود. این منافذ را می توان با کمک شوک الکتریکی و یا شوک حرارتی همراه با مواد شیمیایی ایجاد کرد.

وارد کردن دِنای نوترکیب به یاخته میزبان: همه باکتری ها دنای نوترکیب را دریافت نمی کنند. بنابراین لازم است باکتری دریافت کنندۀ دیسَک از باکتری فاقد آن تفکیک شود.

شکل 4 – تشکیل دنای نوترکیب: الف( قبل از تأثیر لیگاز و ب( بعد از تأثیر لیگاز

شکل ۵ – وارد کردن دِنای نوترکیب به یاخته میزبان

جداسازی یاخته های تراژنی: برای انجام این مرحله، از روش های متفاوتی می توان استفاده کرد. یکی از این روش ها استفاده از دیسَکی است که دارای ژن مقاومت به پادزیستی مثل آمپی سیلین است.

جداسازی یاخته های تراژنی: اگر باکتری، دنای نوترکیب را دریافت کرده باشد، در محیط حاوی پادزیست رشد می کند. باکتری های

فاقد دنای نوترکیب به دلیل حساسیت به پادزیست در چنین محیطی از بین می روند (شکل ۶(.

مهندسی ژنتیک: در شرایط مناسب، باکتری های تراژنی با سرعت بالایی تکثیر می شوند. همچنین از دناهای نوترکیب نیز به صورت مستقل از فام تَنِ اصلی یاخته، نسخه های متعددی ساخته می شود که درنتیجۀ آن دنای خارجی به سرعت تکثیر می شود. بنابراین، تعداد زیادی باکتری دارای دنای خارجی آماده خواهد شد که می توان از آنها برای تولید فراورده یا استخراج ژن استفاده کرد.

امروزه با پیشرفت روش های مهندسی ژنتیک می توان یاخته های دیگری مثل مخمرها، یاخته های گیاهی و حتی جانوری را با این فرایند تغییر داد.

مهندسی ژنتیک: دناها و سایر مولکول های حاصل از دناهای تولید شده برای اهداف گوناگون علمی و کاربردی استفاده می شوند.

شکل ۶ – جداسازی یاخته های تراژنی دارای دنای نوترکیب